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3. RNA-Seq解析にネットワーク解析は必要か？｜意味のないネットワーク図が科学知識になるまで

RNA-Seq解析では、発現差のある遺伝子を抽出したあとに、 ネットワーク解析が追加されることがあります。 複数の遺伝子が線で結ばれ、中心に位置する因子や、 上流にあると推定された転写因子が強調されます。 このような図は、単なる遺伝子リストよりも、 研究対象となる生物学的機構を説明しているように見えます。 しかし、ネットワーク図に描かれた線は、 本当にその研究で確認された関係なのでしょうか。 RNA-Seqから抽出した遺伝子を、 過去の文献情報に基づいて接続しただけであれば、 それは新しい実験結果ではありません。 既存知識を使って作られた仮説図です。

本記事では、公開RNA-Seq、ノックダウン実験、qRT-PCR、 ChIP-Seq、IPAによるネットワーク解析が含まれる GSE95304と このデータを基にした論文 を例に、ネットワーク図が何を示し、 何を示していないのかを考えます。

RNA-Seqで何が分かるのか？｜RNA-Seqを用いた論文の3つのタイプ

RNA-Seqによって、実験条件間で発現差のある遺伝子を抽出することはできます。 しかし、その遺伝子が研究対象となる表現型に関係しているのか、 別の遺伝子を制御しているのか、 あるいは変化の結果として発現が変わっただけなのかは、 RNA-Seqだけでは分かりません。 したがって、RNA-Seqで得られた遺伝子は、 検証実験の対象となる候補として扱う必要があります。 候補遺伝子をノックダウンまたは過剰発現し、 表現型や下流遺伝子への影響を観察することによって、 その遺伝子が研究対象の現象に関与するかどうかを確かめます。

RNA-Seqを用いた論文では、 候補抽出後の進め方を、 大きく次の3つに整理できます。

1. RNA-Seqによる候補抽出までを結果として報告する論文
2. RNA-Seqで抽出した候補の生物学的機能を実験で検証する論文
3. 実験的な機能検証の代わりに、 知識ベース型ネットワーク解析によって 機構的な説明を加える論文

オミクス研究の黎明期には、 研究は主に、候補遺伝子の抽出までを報告する第1のタイプか、 そこから一部の候補を実験的に検証する第2のタイプでした。 しかし、知識ベースを利用した解析ツールが広く使われるようになった現在では、 発現差のある遺伝子を抽出して並べるだけでは、 研究の目的によっては十分な生物学的説明にならないと 考えられることが多くなっています。 そのため、候補遺伝子の機能を実験的に検証する研究に加えて、 ネットワーク解析によって候補間の関係を解釈し、 機構的な説明を加える研究も広く見られるようになりました。

ただし、この二つは同じ意味ではありません。 第2のタイプでは、 RNA-Seqとは別の実験によって新しい証拠が加えられます。 候補遺伝子の機能を実験で確かめたのであれば、 論文で示すべき中心的な結果は、 候補遺伝子の抽出過程と、その機能検証です。 一方、第3のタイプでは、 RNA-Seqから抽出された遺伝子を知識ベース型ツールへ入力し、 過去の文献で報告された関係によって接続します。 そこでは新しい実験証拠が追加されるのではなく、 既存知識が再配置されています。

実験的な機能検証と、 知識ベースから生成されたネットワーク図は、 本来、異なる種類の証拠です。 論文を注意深く読む研究者であれば、 実験で確認された関係と、 既報の情報から推定された関係を区別できます。 しかし、この区別は、 論文の内容がデータベース、知識グラフ、 ネットワーク解析ソフト、文献マイニング、 AIによる論文要約や知識抽出に利用される過程で、 必ずしも維持されるとは限りません。 ネットワーク図を基に書かれた機構的な説明が再利用される際に、 その関係が実験で確認されたのか、 既存知識から推定されただけなのかという情報が失われれば、 未検証の関係が既知の生物学的知識として 再利用される可能性があります。

その結果、過去の文献情報から生成されたネットワークが 新しい論文の解釈として記載され、 その論文が再び知識ベースへ取り込まれ、 次のネットワーク解析の根拠になることがあります。 新しい実験証拠が加わっていなくても、 同じ関係が論文と知識ベースの間を循環することで、 複数の独立した研究によって繰り返し支持された関係のように 見える可能性があります。 これは、いわば知識ベース型ネットワーク解析による マッチポンプです。

知識ベース型ネットワーク解析は、 遺伝子間の関係を線や矢印として具体的に描くため、 未検証の仮説が実在する制御機構のように見えやすくなります。 本記事では、公開データを使って、 ネットワーク図から読み取れる関係が 実際の実験結果によってどの程度支持されるのかを確認します。

実験で観察された関係と、IPAが生成したネットワーク｜GSE95304の例

GSE95304に対応する論文では、 RNA-Seqによる候補抽出だけでなく、 遺伝子ノックダウンによる機能検証も行われています。 上で整理した第2のタイプと第3のタイプを併せ持つ論文と言えます。

Fig. 4Cに掲載されているネットワーク図の意味は？

Fig. 4Bでは、選択された9遺伝子を個別にノックダウンし、 ほかの遺伝子の相対発現量を測定しています。 ノックダウンに伴って別の遺伝子の発現が低下した関係を、 矢印で整理したものがFig. 4Cです。 この図では、矢印がE2F1、EZH2、PAICS、PTP4A1に集中しています。 しかし、Fig. 4Bのヒートマップが示す以上の情報が加わったわけではありません。 むしろ、発現変化の大きさや、上昇した遺伝子についての情報が失われているため、 元のヒートマップより情報量は少なくなっています。 それにもかかわらず、線と矢印で表現されることで、 より安定した制御関係が示されたような印象を与えます。

さらに重要なのは、 これらの発現低下が、直接的な転写制御によって生じたかどうかは分からない ということです。 細胞増殖、細胞周期、ストレス応答など、 共通する細胞状態の変化を介して 間接的に低下した可能性もあります。 したがって、Fig. 4Cの矢印は、 直接的な制御関係を示したものではなく、 特定のノックダウン実験で観察された発現応答を表したものです。

Fig. 4Bのquantitative RT-PCRとFig. 5HのRNA-Seqは、 一部の遺伝子ノックダウン後の発現変化を、 異なる方法で測定した結果です。 ただし、Fig. 4BとFig. 5Hでは、 発現低下を表す色が暖色系と寒色系で逆になっているため、 色の向きに注意して比較する必要があります。

両者を比較すると、 Fig. 4Cで多くの矢印が集まっていたE2F1やEZH2の低下は、 Fig. 5Hでは一貫して再現されていません。 quantitative RT-PCRとRNA-Seqでは、 測定方法だけでなく、使用したshRNA、測定時点、 実験条件、正規化方法などが異なる可能性があります。 そのため、この不一致だけから どちらかの測定が誤っているとは結論できません。

しかし、別の測定では十分に再現されない関係を、 安定した発現制御ネットワークとして一般化することもできません。 測定値を示した図であれば、 条件や測定方法による違いを確認できます。 一方、それを矢印だけの関係図にすると、 元の変化量や条件依存性が見えなくなり、 その関係がどの程度再現性を持つのかを判断しにくくなります。

Fig. 4Dに掲載されているネットワーク図の意味は？

一方、Fig. 4Dでは、9遺伝子とFra-1 (FOSL1)をIPAへ入力し、 IPAの知識ベースに登録された既報の関係を使って、 MYC、TP53、IL-6、VEGFなどを含む より広いネットワークが構築されています。 ここで描かれた関係の多くは、 この研究のLM2細胞で測定されたものではありません。 異なる細胞、組織、疾患、刺激、測定法で報告された関係を含む 既存知識から作られたものです。

したがって、Fig. 4Dは、 この研究対象の細胞内で、 図のとおりのネットワークが機能していることを示すものではありません。 ここから言えるのは、より限定的に、 入力された遺伝子群を、 IPAの知識ベースに登録された関係によって このように接続できるということです。 Fig. 4Dは、実在するネットワークを発見した結果ではなく、 既報の関係から構成可能な仮説図です。

ChIP-Seqでは、発現制御ネットワークを確認できるか

この研究では、Fra-1 (FOSL1)、MYC、E2F1、TP53の ChIP-Seqデータも公開されています。 論文では、このデータを使って、 4転写因子が共通するゲノム領域や 同じ遺伝子のプロモーター付近に結合することを示しています。 著者らは、このようなピークの共通性を 協調的な結合として解釈しています。 ただし、通常のChIP-Seqから分かるのは、 各因子について、そのゲノム領域に由来するDNAが 免疫沈降されたということです。 4因子が同じ細胞の同じDNA分子へ同時に結合したことや、 一つの複合体として機能したことまでは示せません。 また、同じ遺伝子の広いプロモーター領域に 各因子のピークがある場合でも、 ピーク座標が一致しているとは限りません。

ピークを持つ遺伝子と、ノックダウン後の発現を照合する

そこで、公開ChIP-Seqデータから、 各転写因子について転写開始点周辺にピークを持つ遺伝子を 標的候補として抽出し、 対応するノックダウンRNA-Seqの発現パターンと照合しました。

転写因子がある遺伝子の発現を正に制御しているのであれば、 その遺伝子のプロモーター付近にピークがあり、 さらに、その転写因子をノックダウンした際に 発現が低下することが期待されます。

そこで、ChIP-Seqピークを持つ標的候補遺伝子について、 対応する転写因子をノックダウンした際の RNA-Seq発現変化を比較しました。 その結果を以下に示します。

今回の比較では、 TSS付近にChIP-Seqピークを持つ遺伝子が、 対応する転写因子のノックダウンによって 一貫して発現低下するパターンは認められませんでした。 したがって、Fig. 4やFig. 5から想定されるような、 因子特異的で一貫した発現制御ネットワークを このChIP-SeqデータとRNA-Seqデータの対応関係から 確認することはできませんでした。

共通標的の多さは、4因子が対等に協調していることを意味しない

一方、複数因子が同じ遺伝子のTSS周辺にピークを持つという共通性自体は、 公開ChIP-Seqの再解析でも確認できました。 ただし、集合構造を詳しく見ると、 E2F1とTP53は非常に多数の遺伝子にピークを持ち、 この二つの標的候補は大部分が重複していました。 これに対して、FOSL1とMYCの標的候補の重複は、 それほど大きくありませんでした。 したがって、4因子共通の標的候補が多数存在するのは、 4因子が対等な関係で、 限られた共通標的へ選択的に集まっているためというより、 非常に広いE2F1–TP53共通集合に、 FOSL1とMYCの標的候補が部分的に重なっているという 集合構造によるものと考えられます。

ChIP-Seqで共通する標的候補を抽出できることと、 4因子がそれらの遺伝子を協調して発現制御していることは別です。 今回確認できたのはピークを持つ遺伝子の重複であり、 その重複が協調的な発現制御としてRNA-Seqに反映されていることは 確認できませんでした。

実験データから作ったネットワークでさえ、検証は難しい

Fig. 4Bは、実際の遺伝子ノックダウンと発現測定に基づく結果です。 Fig. 4Cは、そこで観察された発現低下の関係を 矢印で整理した関係図です。 それでも、Fig. 4Cで安定した制御関係のように見える特徴は、 同じ論文のRNA-Seq結果を示すFig. 5Hでは 十分に再現されていませんでした。 さらに、公開ChIP-SeqデータとRNA-Seqデータを照合しても、 Fig. 4Cから想定される因子特異的な発現制御関係や、 Fig. 4DのIPAネットワークを支持するような 一貫した関係は確認できませんでした。

つまり、同じ研究内で得られた実験データに基づく関係図であっても、 遺伝子間の安定した制御ネットワークとして 検証することは容易ではありません。 まして、異なる研究条件で蓄積された既報の関係を 知識ベース上で接続したネットワークを、 その研究対象で実在する生物学的機構として解釈することは、 さらに難しいと考えるべきです。

IPAは仮説生成には有用である

IPAのようなツールが無意味ということではありません。 次にどの因子をノックダウンするか、 どの経路を追加測定するか、 どの組み合わせをChIP、レポーターアッセイ、 阻害実験などで検証するかを考えるためには有用です。 つまり、IPAネットワークは、 研究者が次に検証すべき仮説を考えるための 内部資料として使うべきものです。

しかし、そのネットワークを 研究の機構的な結論として論文に掲載するのは問題です。 そうするのであれば、 図に描かれた主要な関係を検証しなければなりません。 一部のノードをノックダウンして、 いくつかの遺伝子の発現が変化しただけでは、 ネットワーク全体や個々のエッジを 検証したことにはなりません。 ネットワーク図を掲載するのであれば、 少なくとも研究の結論に関係する主要な矢印について、 方向性、再現性、条件依存性、 可能であれば直接性を 実験的に確認すべきです。

仮説生成のために利用するのであれば、 未検証の作業仮説として内部資料に用いる。 研究の結果として提示するのであれば、 主要な関係を実験的に検証する。 検証していないネットワークを掲載するとしても、 結果ではなく作業仮説であることを明記すべきです。

未検証のネットワークが科学知識として蓄積される

未検証のネットワーク図を論文に掲載することの影響は、 その論文の中だけにとどまりません。 論文に記載された関係は、 後続研究から参照され、 知識ベースにも取り込まれていくため、 その後の科学知識の形成にも影響を及ぼします。

過去の論文に記載された関係が知識ベースへ登録され、 その知識ベースを使って新しいネットワーク図が作られます。 そのネットワークについて書かれた文章が新しい論文に掲載されると、 その論文もまた、後続研究から参照される情報になります。 この流れを繰り返すと、 最初は限定された条件で観察された関係や、 単なる仮説として提示された関係が、 複数の論文で繰り返し現れるようになります。 同じ情報が知識ベースから論文へ、 論文から別の知識ベースやネットワークへ移動しただけであっても、 見かけ上は複数の研究によって支持された関係に見えることがあります。

さらに、論文やデータベースの情報が 知識グラフやAIによる文献解析へ取り込まれれば、 その関係は既知の生物学的機構として回答や解釈に利用される可能性があります。 このように、ネットワーク解析は既存知識を要約するだけでなく、 検証されていない仮説を、 次の世代の科学知識へ変換する入口にもなり得ます。

ネットワーク図の線を、証拠のように読まない

既報に掲載されたネットワーク図を読むときにも、 その線を実験証拠としてそのまま受け取らないことが重要です。

ネットワーク図は、複雑な情報を整理し、 次の実験を考えるためには便利です。 しかし、線が多いことや、 中心に位置するノードがあることは、 その関係を支持する実験証拠が多いことも、 そのノードが実際の制御ネットワークのハブであることも 意味しません。 ネットワーク図を見るときには、 少なくとも次の点を区別する必要があります。

• その線は、この研究の実験データから得られたのか
• 発現相関、ノックダウン後の変化、物理的結合のどれを表しているのか
• 直接的な関係なのか、間接的な応答も含むのか
• 別の測定法や別の実験条件でも再現されたのか
• 知識ベースから追加された未検証の関係ではないか

ネットワーク図が示す線を一つずつ、 元の実験データや根拠となる文献へ戻せなければ、 その図を生物学的機構の証拠として扱うことはできません。

まとめ｜論文に載せるのであれば、検証する

RNA-Seq解析にネットワーク解析が必須なわけではありません。 RNA-Seqで候補を抽出し、 その候補を機能的に検証したのであれば、 その結果だけでも研究として成立します。

IPAのような知識ベース型ツールは、 次に検証すべき関係を考えるためには有用です。 しかし、生成されたネットワークは、 その研究で確認された機構ではありません。

ネットワーク図を論文に掲載し、 そこから生物学的機構を論じるのであれば、 主要なノードとエッジを実験的に検証する必要があります。 検証していないネットワークは、結果ではなく作業仮説です。

仮説として使うだけなら内部資料でよい。 論文に載せるのであれば、検証する。 ネットワーク図を科学知識として提示するためには、 その線が何を意味し、 どの実験によって支持されているのかを 説明できなければなりません。