この記事では、Windows版Subio PlatformのFASTQ to VCF（RNA-Seq）ツールを使用するための実行環境の設定方法を説明します。
macOS版の設定方法はこちらをご覧ください。
これを始める前に
あらかじめRNA-Seq FASTQファイル処理パイプラインの設定方法（Windows版）に従って、WSL、fastp、HISAT2の設定を完了してください。 これらはFASTQ to VCF（RNA-Seq）でも共通して使用するため、ここでは説明を省略します。
環境設定パネル
FASTQ to VCF（RNA-Seq）の実行には、追加でJava 17、GATK、Python 3、および参照データの設定が必要です。 Java 17とGATK 4.7.0.0の組み合わせで正常に動作することを確認しています。
GATK Resource Bundleはヒトの参照ゲノム（b37/hg19、GRCh38/hg38）に対応しています。 このツールで使用する参照データはヒト用であり、ヒト以外の生物種には対応していません。
なお、HISAT2の公式サイトで配布されているGRCh38用Indexでは、染色体名が「1」のように番号のみで表記されています。 一方、GATKの参照データには「chr1」のようにchrが付いた染色体名が使用されているため、そのまま組み合わせるとエラーが発生します。 この問題に対応するため、GRCh38用の chr付きHISAT2 Indexと GTFファイルを用意しています。 ZIPファイルをダウンロードして展開し、使用してください。
1. Java 17 Executable
Eclipse Temurinから、Java 17のLinux x64用JDKをダウンロードします。
ダウンロードしたアーカイブを展開し、Subio Platformの設定画面で、
展開したフォルダー内のbin/javaにある実行ファイルのパスを指定してください。
2. GATK jar Executable
GATKの公式リリースページから、
動作確認済みの
gatk-4.7.0.0.zip
をダウンロードします。
ZIPファイルを展開し、Subio Platformの設定画面で、
展開したフォルダー内のgatk-package-4.7.0.0-local.jarのパスを指定してください。
3. Python 3 Executable
HISAT2のhisat2-inspectを実行できるバージョンのPython 3を指定します。
Subio Platformの設定画面で、Python 3の指定欄にある「Find」ボタンをクリックしてください。
hisat2-inspectを正常に実行できるPythonが見つかった場合は、
候補として表示されるので、その中から選択します。
候補が表示されない場合は、対応するバージョンのPythonをインストールしてから、
再度「Find」ボタンをクリックしてください。
HISAT2 2.2.1では、Python 3.12以降で削除されたimpモジュールが必要なため、
Python 3.11以前を使用してください。
Python 3.11をバージョン指定して追加インストールする場合も、
既存のシステムPythonを置き換える必要はありません。
4. GTF/GFF3 File
GRCh38の場合は、 こちらからGTFファイルをダウンロードしてください。 このGTFファイルは染色体名に「chr」を付加している点で、Ensemblが提供する元のファイルとは異なります。 正しく動作させるには、 chr付きHISAT2 Index と組み合わせて使用してください。
5. dbSNP VCF File
gcp-public-data--broad-references
から取得します。
GRCh38の場合は、
hg38/v0フォルダー
にあるHomo_sapiens_assembly38.dbsnp.vcfをダウンロードしてください。
6・7. Known Indels VCF Files
dbSNPと同様に、
hg38/v0フォルダー
から、Homo_sapiens_assembly38.known_indels.vcfと
Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg38.vcfをダウンロードしてください。
ファイル名が一覧に見つからない場合は、2ページ目も確認してください。
VCFファイルの拡張子について
Google Cloud上では.vcf.gzという拡張子で表示されていても、
ダウンロード後に.vcfなどに変わる場合があります。
非圧縮のVCFファイルとgzip圧縮されたVCFファイルのどちらも使用できますが、
実際のファイル形式と拡張子が一致していることを確認してください。
hg19で解析する場合
hg19（GRCh37）で解析する場合は、 HISAT2の公式サイトから提供されている HISAT2 Index（grch37_genome.tar.gz）と、 GRCh37用GTFファイルを使用してください。 dbSNPとKnown Indelsには、以下のファイルを使用します。
- hg19_v0_Homo_sapiens_assembly19.dbsnp138.vcf.gz
- hg19_v0_Homo_sapiens_assembly19.known_indels.vcf.gz
- hg19_v0_Mills_and_1000G_gold_standard.indels.b37.vcf.gz
HISAT2 Indexには、hg19_genome.tar.gzではなく、 grch37_genome.tar.gzを使用してください。 今回使用するGTFファイルとVCFファイルは、 染色体名に「chr」が付かない形式です。