Subio PlatformのFASTQ to VCFツールは、 RNA-SeqのFASTQファイルから、SNPやindelなどのゲノム変異を検出する機能です。 ヒトのRNA-Seqデータを対象としており、 FASTQファイルの前処理から変異検出までを一連のパイプラインで実行できます。
このパイプラインは、 GATKのRNA-Seq short variant discoveryワークフロー を参考にしています。 ただし、メモリー使用量を抑えるため、 リードのマッピングにはSTARではなくHISAT2を使用しています。
このツールはヒトのRNA-Seqデータ専用です。 ヒト以外の生物種には対応していません。
1. 実行環境を設定する
FASTQ to VCFを初めて使用する場合は、 FASTQファイルの前処理やマッピングに使用するツールに加えて、 Java、GATK、Python、参照ゲノムなどの設定が必要です。 お使いのOSに対応した以下の記事に従って、実行環境を設定してください。
参照ゲノム、HISAT2 Index、GTFファイル、dbSNP、 Known Indelsなどの参照データは、 互いに対応するゲノムバージョンのものを使用する必要があります。 詳しくは、それぞれの環境設定記事をご覧ください。
2. FASTQ to VCFを実行する
実行環境の設定が完了したら、 FASTQ to VCFツールを開き、 解析するFASTQファイルと必要な設定を指定して処理を開始します。
パイプラインでは、FASTQファイルの前処理、 リファレンスゲノムへのマッピング、GATKによる変異検出などの処理が 順番に実行されます。 解析結果として、検出された変異を記録したVCFファイルが出力されます。
以下の動画では、FASTQ to VCFツールの基本的な操作方法を紹介しています。
3. 処理の中断・再開
FASTQ to VCFは、処理の一時停止・停止と、 保存済みの処理結果を利用した再開に対応しています。
過去の実行結果をサンプルや処理工程ごとに検証し、 完了済みの処理を再利用して、必要な工程から再開できます。 そのため、処理を中断した場合やエラーが発生した場合でも、 最初からすべての処理を実行し直す必要はありません。
また、処理に失敗した場合の自動再試行や、 スレッド数・並列数を減らした再試行にも対応しています。
4. 処理が正常に終了しない場合は実行ログを確認する
FASTQファイルの処理中にエラーが発生した場合は、 FASTQファイルが保存されているフォルダー内に生成される 一時フォルダーを確認してください。
その中にあるrun.logには、
使用したツールや解析条件、パイプラインの実行状況、
エラーに関する情報などが記録されています。
run.log.gzとしてgzip圧縮されている場合は、
解凍してから内容を確認してください。
run.logをChatGPTなどのAIに読み込ませて、
エラーの原因や対処方法を相談すると、
問題解決の手がかりが得られる場合があります。
5. RNA-Seqによる変異検出の注意点
RNA-Seqでは、発現している遺伝子に由来するリードを解析するため、 ゲノム全体の変異を網羅的に検出できるわけではありません。 発現量が少ない遺伝子や、十分なリードが得られない領域では、 変異を検出できないことがあります。
また、スプライスジャンクション付近のマッピングの誤りや RNA editingなどが、変異検出結果に影響する場合があります。 検出された変異を解釈する際は、 リードの品質やカバレッジなども考慮してください。
RNA-Seqから得られた変異検出結果を研究上の重要な判断に利用する場合は、 DNAシーケンスなどの別の方法による確認も検討してください。