RNA-Seqの発現差解析では、p値だけでなく、 adjusted p-valueやFDR（False Discovery Rate）を使うことが標準的な考え方とされています。
数千から数万の遺伝子を同時に検定するため、 p値だけを見て候補遺伝子を選ぶと、 偶然に小さなp値を示した遺伝子が多数含まれる可能性があります。 そのため、多重検定補正を行い、 FDRを考慮することには明確な意味があります。 この点で、バイオインフォマティシャンがFDRを推奨するのはもっともなことです。 また、レフリーが「FDR補正を行ったのか」 「adjusted p-valueで評価しているのか」と確認するのも当然です。
しかし、FDR < 0.05を満たすかどうかだけで、 すべてのRNA-Seq解析結果を機械的に判断してよいのでしょうか？
FDRを求めるレフリーの懸念は正しい
前述のとおり、FDRを求めること自体は決して間違っているわけではありません。
RNA-Seqでは、多数の遺伝子について同時にp値を計算します。たとえば、本当は差がない2万遺伝子をp < 0.05で検定すれば、偶然に小さなp値を示すものが期待値として約1000個含まれます。そのため、p < 0.05だけを基準にして遺伝子リストを作れば、 その中には偽陽性が多く含まれる可能性があります。 この問題を避けるために、FDR補正を行うこととされています。
特に、解析パイプラインで 大量の検定結果を自動的に処理し、 一定の基準で発現差遺伝子リストを出力する場合には、 FDRは重要な安全装置になります。 データを一つ一つ確認せず、p値だけで遺伝子を選ぶのであれば、 FDRを使って偽陽性を抑える必要があるというのは妥当です。
しかし、FDR < 0.05は絶対ルールではない
一方で、FDR < 0.05は、 無条件に適用すべき絶対ルールではありません。
FDRを推定する方法はいくつかありますが、現実的にはBenjamini-Hochberg（BH）法による補正が広く使われています。 しかし、BH法が広く使われているのは、RNA-Seqデータに対して統計学的に完全な方法だからではありません。 Bonferroni補正のような方法では厳しすぎて、探索解析ではほとんど候補が残らないことがよくあります。 そのため、補正なしのp値と、非常に厳しい補正法の間にある現実的な方法として、BH法によるFDR補正が広く使われています。
Fig. 1: edgeRおよびDESeq2で計算したp値のヒストグラム。 実際のRNA-Seq発現差解析で得られるp値分布は、0から1まで単純に一様に広がる形ではなく、 このように大きく偏った形になることがよくあります。 このことは、BH法によるFDR補正が有用であっても、 データの複雑さをすべて解決する絶対的な判定基準ではないことを示しています。
つまり、BH法は「これを使えばRNA-Seq解析の統計的な問題がすべて解決する」という方法ではありません。 多数の検定を扱ううえで、偽陽性をある程度抑えながら、探索解析として使える候補も残すための、 実務上の妥協点として推奨されているのです。
n=3、n=30、n=300で同じFDR < 0.05を求めてよいのか
FDR < 0.05という基準は、しばしば当然のように使われます。 しかし、サンプル数が3の場合、30の場合、300の場合で、 同じようにFDR < 0.05を絶対条件にすることが 常に合理的とは限りません。
サンプル数が少ない解析では、自由度が低いためadjusted p-valueは厳しくなりやすくなります。 そのため、fold changeが大きく、生物学的に興味深い変動を示していても、 FDR < 0.05を満たさないことがよくあります。 このようなデータで、 FDR < 0.05を満たす遺伝子だけを 「見る価値がある候補」として扱うと、 探索解析としては候補を狭めすぎる可能性があります。
一方、サンプル数が非常に多い解析では、 ごく小さな変動であってもp値が極めて小さくなり、 FDR < 0.05を満たしやすくなります。 その場合、FDR < 0.05を満たしていることだけでは、 その変動を重視すべきかどうかは判断できません。
つまり、FDR < 0.05という同じ数字でも、 その意味はサンプル数やデータの性質によって大きく変わります。 FDRの閾値を固定しても、 解析判断の妥当性まで固定できるわけではありません。
検定対象を絞ることは、常に不適切なのか
FDRを考えるときには、 どの遺伝子集合に対して検定を行っているのかも重要です。
標準的なRNA-Seq発現差解析でも、 すべての遺伝子を無条件に検定対象にしているわけではありません。 多くの解析では、低Countsの遺伝子を事前に除外します。 低Countsの遺伝子では、 カウントデータの相対的なばらつきが大きく、 モデルに基づく推定や検定が不安定になりやすいためです。 このような遺伝子を検定前に除外することは、 統計的な厳密性を損なう操作ではなく、 むしろ検定を意味のある対象に限定するための処理です。
では、低Countsの遺伝子を除外することは認められるのに、 発現変動していない遺伝子を検定から除外することは否定されるべきなのでしょうか？
edgeRやDESeq2では、カウントデータ全体の分散構造を用いてモデルを推定します。 そのため、edgeRやDESeq2を使うことを前提とする標準的なワークフローでは、 低Counts遺伝子を除外したうえで、 残った遺伝子集合全体に対して検定を行うことが必要です。
一方で、正規化後の発現値に対して遺伝子ごとに検定を行う t検定やノンパラメトリック検定では、 低発現遺伝子を除外するだけでなく、発現変動がほとんどない遺伝子をあらかじめ除外し、 変動を評価する意味がある遺伝子に限定して検定を行う、という考え方もあり得ます。
これは、結果を見た後で都合のよい遺伝子だけを残す操作とは異なります。 検定前にどのような基準で検定対象となる遺伝子を定義したのか、 その基準が解析目的に合っているのかを明示するのであれば合理的です。 FDRを解析で使うという前提であれば、 検定対象に含める遺伝子を事前に適切に絞り込むことで、 本来注目すべき候補遺伝子を不必要に落とさないようにする、 という考え方は自然です。
p値とfold changeを組み合わせる時点で、解析は単なる仮説検定ではない
実際のRNA-Seq解析では、 p値やFDRだけで候補遺伝子を決めることは多くありません。 普通はp値またはadjusted p-valueに加えて、 fold changeの条件を組み合わせます。 この時点で、解析はすでに 純粋な仮説検定ではなくなっています。
p値とfold changeを組み合わせること自体は、 実務上とても自然です。 統計学的に有意な遺伝子が欲しいのでなく、生物学的に意味のある変動を見出すことが目的だからです。
しかし、それを認めるのであれば、 FDRを絶対的なルールとみなすのではなく、 解析目的に応じて柔軟に運用するほうが有益ではないでしょうか。
ポイントは、p値やFDRを「どう」使うのか
p値やFDRの扱いは、 その結果をどう使うのかによって変わります。
発現差遺伝子リストを、 論文の主要な結論として「統計的に有意な遺伝子」として示すのであれば、 FDRに基づいて慎重に評価する必要があります。 しかし、実際の研究では、RNA-Seq解析の結果をそれ自体で最終結論とするよりも、 次に詳しく調べる候補遺伝子やパスウェイを見つけるための探索として使う場面の方が多いはずです。
その場合、FDR < 0.05を満たさない遺伝子を機械的に捨てることは、 偽陰性を増やすことにつながります。 RNA-Seq解析を探索として使うのであれば、 p値やFDRは、候補を評価するための一つの指標として扱うべきです。
ポイントは、RNA-Seq解析で得られた候補を、
それ自体で最終結論として扱うのか、
それとも、qPCR、別データセット、機能実験、エンリッチメント解析などへ進めるための
候補として扱うのかを明確に区別することです。
参照：RNA-Seq DEG解析とは？ - p値、edgeR、DESeq2だけでは語れない発現差解析
FDRを使わない場合に説明すべきこと
FDR < 0.05を唯一の基準にしない場合には、 その代わりに、どのような判断基準で候補を選んだのかを 明確に説明する必要があります。 発現量、fold change、サンプル間の一貫性、 ヒートマップ上の発現パターン、 関連するパスウェイとの整合性、 そして次に行う操作との関係などを、第三者が納得できるよう具体的に説明する必要があります。
たとえば、論文やレフリーへの回答では、 次のように説明できます。
本解析では、p値およびFDRを、 候補遺伝子を評価するための指標の一つとして扱いました。 ただし、候補の選定はadjusted p-valueの閾値のみには依存せず、 発現量、fold change、サンプル間の一貫性、 ヒートマップ上の発現パターン、 および関連する生物学的経路との整合性を合わせて判断しました。
これは、RNA-Seq解析を最終的な結論ではなく、 次に検証すべき仮説を得るための探索として位置づけたためです。 したがって、FDR < 0.05を満たす遺伝子のみを機械的に採用するのではなく、 実験的検証に進める価値のある候補を広く評価しました。
このように説明すれば、 「FDRを無視した」のではなく、 「FDRを唯一の自動判定基準とはせず、 研究目的に応じて複数の情報を合わせて判断した」 というロジックになります。
再現性とは、生データとコードの公開だけではない
近年、研究の再現性を高めるために、 生データや解析コードを公開することが強く求められています。 これは非常に重要です。
しかし、生データとソースコードを公開するだけで、 解析の再現性が十分に担保されるわけではありません。
なぜなら、RNA-Seq解析では、 どの段階でどの遺伝子を候補として扱うか、 どの閾値を使うか、 低発現遺伝子をどう扱うか、 FDRを使うかといった判断が、 そのデータ解析の信頼性や結果の解釈に大きく影響するからです。
したがって、本当に共有されるべきなのは、 単なる実行結果だけではありません。 どのようなステップを踏んだか、そのときなぜそのような手法や閾値を選んだかという、 解析上の判断プロセスそのものです。
デフォルトは絶対ルールではない
FDR < 0.05をデフォルトとして使うことは理解できます。 むしろ、多数の検定結果を扱うRNA-Seq解析では、 FDRを考慮しないと危険な場合があります。
しかし、デフォルトは絶対ルールではありません。 デフォルトとは、何も判断しない場合の出発点であって、 実際のデータを見て、研究目的を考え、 解析結果を解釈するうえでは 必要に応じて見直されるべきものです。
多くの解析ソフトウェアやRパッケージは、 FDR < 0.05だけを固定された唯一の出力として 強制しているわけではありません。 p値、adjusted p-value、fold change、発現量、 フィルタリング条件などを確認し、 ユーザーが目的に応じて閾値や評価基準を選べるようになっています。
これは、RNA-Seq解析が単なる自動判定ではなく、 データを見ながら判断することが必要な複雑なプロセスであることを示しています。
FDRを使うことが誠実なのではありません。 FDRをどのような目的で使い、 どの場面ではFDRだけに依存しなかったのかを説明できることが、 誠実な解析なのだと思います。
バイオロジストが解析を理解して議論できることが重要
FDRを絶対的な基準にしないためには、 なぜその遺伝子やパスウェイを候補として扱うのかを、 データに基づいて説明できる必要があります。
そのためには、バイオロジスト自身が解析結果を理解し、 発現量、fold change、p値、adjusted p-value、PCA、クラスタリング、 GO解析・Pathway解析の結果を見ながら、 研究目的に照らして議論できることが重要です。
バイオインフォマティシャンがFDRを推奨するのは、 多数の検定結果をp値だけで機械的に扱う危険を避けるためです。 その懸念は正当なものです。
しかし、本当に必要なのは、FDRを使うか使わないかという二択ではありません。 様々な視点から客観的なデータを提示し、どのように判断したかを説明できることです。
Subio Platformでデータを見ながら判断する
Subio Platformは、そのための環境として設計されています。
RNA-Seq解析の結果を、 単なる遺伝子リストやp値の表として見るのではなく、 発現パターン、サンプル間の関係、クラスタリング、 PCA、 GO解析・Pathway解析と結びつけて確認できます。
このように、解析結果を見ながら考えることで、 バイオロジストは 「FDR < 0.05だったから」という説明だけでなく、 「この候補は、発現パターン、効果量、経路上の一貫性から見て、 次に検証する価値がある」 と説明できるようになります。
これは、レフリーへの反論のためだけではありません。 研究者自身が、RNA-Seqデータから何を読み取り、 何を次に検証すべきかを考えるために必要なことです。
まとめ：FDRは必要だが、FDRに判断を丸投げしない
RNA-Seqのように多数の遺伝子を同時に調べる解析では、 FDRを考慮しなければ、 偶然に小さなp値を示した遺伝子を過大評価してしまう危険があります。 そして、FDRを求めるバイオインフォマティシャンやレフリーの懸念は正当です。 特に、データを見ずに自動的に処理する場合には、 FDRは重要な安全装置になります。
しかし、FDR < 0.05は どんなときにも守るべき絶対ルールではありません。
大切なのは、FDRを使ったかどうかではなく、 解析者自身が各解析ステップにおいて選択した手法や閾値の理由について きちんと説明できることです。
FDR < 0.05を基準にするなら、その理由を説明する。
FDR < 0.05だけに依存しないなら、 その代わりに何を見て判断したのかを説明する。
この説明があれば、 FDRは「従うべき絶対ルール」ではなく、
研究全体の中で適切に使うための一つの判断材料になります。
Subio Platformは、バイオロジストがデータを見ながら解析を理解し、 バイオインフォマティシャンやレフリーと議論するためのプラットフォームです。
