1. 解析ソフト
2. Subio Platform
3. マイクロアレイのダイナミックレンジの比較

同じサンプルをマイクロアレイで２回測定して比べることを想像してください。 二つの測定値で散布図を描くと、Fig4とFig5のようになりました。 あなたなら、どちらが質の高いデータだと思いますか？

Fig4のほうがばらついているように見えます。 相関係数を計算すると、Fig4では0.919、Fig5では0.988となりました。 多くの人がFig5のほうが良いデータだと思うのではないでしょうか。 実はこの二つは、もともと同じ生データをMAS5（Fig4）とRMA（Fig5）というアルゴリズムを使ってシグナル値を計算したものです。 二つのアルゴリズムの特徴についてはMAS5とRMAについての解説をご覧いただくとして、ここでは「再現性」について考えます。

たしかに高い相関係数は再現性が高いことを表しますが、「相関係数が高いから再現性が高く質のいいデータである」とは言えないのです。

あるサンプルにおいてすべての遺伝子が発現しているとは生物学的に考えられません。 また、すべての測定システムはきちんと測定できるダイナミックレンジがあり、その限界を超えた領域では正しく測定できません。 マイクロアレイで測定したシグナル値の中には、発現していない遺伝子と、測定できないほど発現量が少ない遺伝子のものも必ず含まれています。 このような測定値は、値がとても低い領域で、繰返しサンプルにおいて再現性がないように見えることが予想されます。

Fig4では予想どおりノイズ領域が見られるのですが、Fig5では見られません。 しかしノイズが無いということは実験生物学の立場からあり得ないことなので、Fig5ではノイズが隠れていると考えられます。

データを解釈する立場からは、ノイズが隠れていることはとても厄介です。 なぜならノイズがノイズとして見えるから、シグナルとノイズの境界がわかり、測定値が信頼できるシグナル領域の遺伝子群を簡単に抽出できます（Fig4の黒）。 しかし、ノイズが隠れているFig5では、これが簡単にできないのです。 ただし、ヒストグラムを注意深く見ると、左側（値の低い領域）に高い山が見えます。 Fig4で抽出したシグナル領域の遺伝子群（黒）は、Fig5においてもよく似た分布をしていますから、やはりこの山がノイズ領域と考えられます。

「高い相関係数は再現性が高いことを表す」のは、シグナル領域において成立することです。 ノイズ領域では通用しません。 従って、相関係数はシグナル領域の遺伝子だけで計算するべきものであって、すべての測定値を使うのは適切ではありません。 これを混同するから、相関係数を高く見せるためにノイズを隠すようなアルゴリズムが作られます。 また、ダイナミックレンジとはシグナル領域を指すのであって、すべての値の分布域のことではないということを正しく理解する必要があります。 そして、ノイズがノイズとして見えることに、実はとても価値があるのです。

それでは以上をふまえて、マイクロアレイのダイナミックレンジを見ていきましょう。

ダイナミックレンジを4桁とか5桁とかいう値を以て比較するのは、100キロメートルは80マイルより長いと主張するようなものです。 マイクロアレイの測定値は、それぞれの機械と数値化アルゴリズムに依存し、同じ単位の数値ではありません。 従って、測定値の分布の幅を比較してもしかたがありません。 ダイナミックレンジの比較は、シグナル領域にある遺伝子の数でするのです。 言い換えれば、何個の遺伝子がちゃんと測定できるかを問うのです。

Affymetrix 3' IVT GeneChip

2002年から2004年にかけて大量に使われたマイクロアレイで、代名詞的な製品でした。 Fig4およびFig5のデータはHuman Genome U133 Plus 2.0 Arrayのもので、このタイプのマイクロアレイの典型なデータでは、シグナル領域（黒い領域）にだいたい25,000個くらいのプローブセットがあって、遺伝子に対して複数のプローブセットが設計されていることも多いので、それを差し引いておよそ12,000個の遺伝子を測定できます。

理論的にはノイズ成分とシグナル成分を分けて考えることができますが、実際のデータではきれいに分かれていないので、境界は線ではなく帯またはスペクトルのようなものになります。 ノイズ領域とシグナル領域の重なりが大きければ、ヒストグラムで見ると境界領域は山型になります。 MAS5 (Fig4) では、黒いシグナル領域のすぐ左に山型が見えます。 ここがノイズ成分とシグナル成分が混じっている境界領域です。 そして、その左側の裾野はノイズだけの領域です。 信頼性は落ちますが、境界領域のデータも使えなくはありません。 しかし、RMAのデータ (Fig5) ではそのような分離はできません。

GSE11670のデータをSSA形式でダウンロードして、Subio Platformで詳しくご覧ください。

Illumina BeadChip

GeneChipより後発で製品化されたもので、非常に高い再現性を謳っていました。 HumanHT-12 V4.0 expression beadchipのデータを散布図（Fig6）を見るとばらつきが無いように見えますが、これは上述のRMAの効果にすぎません。 シグナル領域にあるプローブはおよそ15,000個で、遺伝子数にして11,000個くらいです。 Affymetrixの3' IVT GeneChipと比べると、ダイナミックレンジは狭くなっています。 また、RMAによりデータの解釈が難しくなるのですが、それ以外の数値化手法を選択できません。

GSE25315のデータをSSA形式でダウンロードして、Subio Platformで詳しくご覧ください。

Affymetrix Gene ST Array

Affymetrixによる3' IVT GeneChipの後発なのですが、このデータの特徴は、IlluminaのBeadChipと同様に数値化ソフトウェアによってバイアスとノイズを隠していることと、シグナル成分とノイズ成分の境目が非常に分かりにくいということです。 Fig7でいうと、シグナル値がだいたい6以上の領域では、発現量が下がるにしたがってばらつきが大きくなっています。 これは自然な形です。 しかしそこから下は逆に収束していきます。 これはソフトウェアによって作られた不自然な形です。 このような意味でシグナル領域をとると、プローブセットで12,000～15,000個、遺伝子数で9,000～11,000個が測定可能のようです。

ちなみに、ノイズ領域をもっときちんと知りたいと思うなら、その細胞で発現していない遺伝子を検索してみてください。 そのような遺伝子が観測される領域がノイズ領域です。 ただし、ノイズ成分とシグナル成分が混在する領域が広いので、実際の解釈はとても難しいです。

Affymetrixの製品は、Plus 2.0シリーズ以降、新しい製品ほどダイナミックレンジが狭くなっていたのですが、最新のClariom S Arrayに至っては大幅に縮小しました。 かつてのテクノロジーリーダーの面影は、完全に見えなくなりました。

GSE22288のデータをSSA形式でダウンロードして、Subio Platformで詳しくご覧ください。

Agilent Whole Genome 4x44k Microarray

Agilentの、これより前の世代のマイクロアレイは質の良いものではなかったのですが、この製品以降は他の追随を許さない圧倒的なダイナミックレンジの広さを誇っており、その地位は2004年の発売以来一度も揺らいでいません。 Fig8のように、シグナル領域にある数はプローブ数でおよそ34,000個、遺伝子数で16,000個以上になります。 ダイナミックレンジが広いということは、中～低発現領域の遺伝子の発現量を測定できるようになったということですが、生物学的にはさらに大きな意味があります。

上述のとおりノイズ成分とは、発現していない遺伝子と、発現が低すぎて正確に測定できない遺伝子が不可分に混ざり合ったものです。 発現していない遺伝子を分離するには、測定感度が上げて後者の成分を減らすしかありません。 つまり、4,000～5,000個の低発現領域の遺伝子を測定できるようになるだけでなく、発現していないと考えられる遺伝子もわかるようになるということです。 発現のON/OFFスイッチの切り替えを見るためには高い感度が必要なのです。

GSE36082のデータをSSA形式でダウンロードして、Subio Platformで詳しくご覧ください。

RNA-Seqとの比較

RNA-Seqのダイナミックレンジは、原理的にリード数に依存します。 リード数が2000万～5000万だとAffymetrix 3' IVT GeneChipと同程度の性能と言えるでしょう。 そして、Agilentのマイクロアレイに匹敵する性能を得るには、1億（paired-endなら2億）くらいのリード数が必要だろうと予想されます。

上記のとおり、マイクロアレイによってダイナミックレンジおよびデータの特徴はさまざまです。 もしあなたが、発現の高い上位10,000個～12,000個の遺伝子を解析したいのであれば、おおむねどのプラットフォームを選んでもかまわないです。 しかし、それよりも低い発現量の4,000～5,000個の遺伝子も見たい場合は、アジレントのマイクロアレイ以外の選択肢はありません。

ノイズを持たない測定データは存在しません。 もしノイズがないように見えるのであれば、どうしてそうなのかをよく考えて、シグナル領域とノイズ領域の見えない境目を見究める必要があります。 いうまでもなくこれは非常に難しいです。 したがって良いデータとは、解析しやすく、信頼性の高い解析結果を出せるデータのことで、それはつまり下記の特徴を持っていることだと言えます。

• ノイズがノイズとして明確に見えている。
• シグナル領域にあって、測定値の信頼できる遺伝子の数が多い。
• シグナル領域とノイズ領域の重なりが少ない。
• 発現差の検出感度が高い。

４番目のポイントについてはこれまで述べていませんでしたが、再現性が高いように見せるための処理が施されているRMAなどでは、サンプル間のばらつきと同時に、発現差の検出感度も落ちています。 研究対象の発現差が小さいと予想される場合は、この点にもご注意ください。